H SEDA VATANSEVER, V SEVİNÇ İNAN
Medeniyet Medical Journal - 2000;15(3):164-167
Gen işaretlemesi ve transjenik fare oluşturulmasında bakteriyel beta galaktosidaz, reporter gen olarak sıkça kullanılır. Bu gen, embriyoya ya fertilize ovuma DNA'sının mikroinjeksiyonu ya da post implantasyon dönemindeki embriyoya ya da embriyonik kök hücresine retrovirus injeksiyonu yapılarak iki yolla uygulanır. Gen hangi yolla verilirse verilsin injekte edildiği hücrenin germ hücrelerine girerek bu geni içeren hücrelerin işaretlenmesi sağlanmış olur. Bu yolla elde edilen embriyo veya hücrelerin incelenmesi işaretlenmiş genin dağılımını ve fonksiyonunun anlaşılmasında yararlı olacaktır. Bu amaçla basal membran proteinlerinden Laminin'in embriyogenesis sırasında gelişen basal membran formasyonundaki ve embriyo gelişimindeki önemini araştırmak üzere embriyonik kök hücrelerinde bulunan Laminin'in üçüncü zincirine (gama1) ait LAMCl geni, Lac-Z geni ile işaretlendi. Wild-type (+/+), heterozigot (+/-) ve homozigot (-/-) embriyonik kök hücreleri elde edildi. İşaretlenmiş olan gen Sorthen ve Northen blotting yöntemleri ile tanımlandıktan sonra genin dağılımını ve hangi hücreler tarafından salındığını araştırmak üzere embriyonik kök hücreleri embriyoblast geliştirmek üzere in vitro olarak bir hafta kültür ortamında tutuldu. Her üç gruptan alınan embriyoblastlar % 4'lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra 7 ( frozen kesitler alındı ve X-gal solüsyonu ile boyanarak Normasky objektifi ile boyama değerlendirildi. X-gal solüsyonu ile mavi renk veren Lac-Z geni içeren hücreler incelendi. Fakat, siyah-beyaz fotoğraf filmi kullanıldığı için boyanma siyah olarak gözlenmiştir. Embriyoblastlar içte ektoderm kökenli ve dışta da endoderm kökenli 2 hücre grubu içerirler. Wild type embriyoblastlar da boyanma gözlenmedi. Heterozigot embriyoblastlarda hem iç hem de dış hücrelerde yer yer boyanma gözlenirken, homozigot embriyoblastlarda boyanmanın dışta yani endoderm hücrelerinde bariz olduğu, bununla beraber iç hücrelerde de yer yer boyanmanın olduğu görüldü. Bu sonuçlar doğrultusunda, elde edilen homozigot embriyoblastlarda laminin gama 1 geninin başarı ile işaretlenmiş olduğu ve bu genin bu hücre grubunda, dıştaki yani endoderm kökenli hücreler tarafından sentez edilip salındığı saptanmıştır. X-Gal solüsyonu kullanılarak yapılan boyamalar sonucunda, Lac-Z geni ile işaretlenmiş hücreler kolaylıkla tespit edilebileceği ve çalışmalarda güvenilir bir yöntem olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.
